HPLC 用于各個(gè)行業(yè)。例如，在制藥領(lǐng)域，用于分析微量雜質(zhì)和活性成分；在食品、飲料、環(huán)境領(lǐng)域，用于分析營(yíng)養(yǎng)成分、功能成分、添加劑、殘留農(nóng)藥；在生物化學(xué)、用于分析蛋白質(zhì)和核酸相關(guān)物質(zhì) 用于分析物質(zhì)。

HPLC 原理和所用色譜柱

HPLC 和氣相色譜 (GC) 是色譜法的類型。色譜法是使分析對(duì)象物中含有的各化合物一邊被吸附一邊通過(guò)色譜柱，根據(jù)各成分的吸附力的差異進(jìn)行分離的方法。樣品成??分流動(dòng)的介質(zhì)（例如 HPLC 溶劑和 GC 氣體）稱為“流動(dòng)相”，而吸附樣品的材料（例如色譜柱）稱為“固定相”。
樣品和色譜柱中所含組分之間相互作用的類型和程度根據(jù)色譜柱的類型而有所不同。例如，ODS 柱用烷基鏈（十八烷基）修飾，通過(guò)疏水相互作用吸附樣品。

另一方面，在硅膠柱中，表面的硅烷醇基團(tuán)吸附極性化合物。此外，還有苯基、氰基、氨基修飾的色譜柱。

使用 HPLC 峰面積計(jì)算濃度

HPLC 峰面積與樣品濃度成正比。然而，使用紫外檢測(cè)器時(shí)，即使樣品濃度相同，峰面積也會(huì)根據(jù)消光系數(shù)（吸收光的容易程度）而變化。因此，使用HPLC進(jìn)行濃度分析時(shí)，需要準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)比較面積。

濃度分析的一種方法是“外標(biāo)法”。在該方法中，制備多個(gè)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，并進(jìn)行 HPLC 分析以確定峰面積。由于每個(gè)樣品的濃度是已知的，通過(guò)繪制面積值和濃度，可以獲得根據(jù)面積值計(jì)算濃度的公式。

第二種方法是“內(nèi)標(biāo)法”。在此方法中，將另一種化學(xué)和物理穩(wěn)定的化合物作為內(nèi)標(biāo)添加到已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品中。添加后，進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比。橫軸為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的添加比例，縱軸為峰面積比，由此可以求出校準(zhǔn)曲線。

HPLC 檢測(cè)器和檢測(cè)限

各種設(shè)備作為 HPLC 檢測(cè)器出售。示例包括紫外-可見(jiàn)光譜 (UV-Vis) 檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器和示差折光檢測(cè)器 (RID)。這些檢測(cè)器的檢測(cè)限根據(jù)樣品的不同而有很大差異。例如，UV-Vis 檢測(cè)器的檢測(cè)限約為 10 皮克 (pg)，熒光檢測(cè)器的檢測(cè)限約為 0.1 pg。

最靈敏的方法是質(zhì)譜儀(MS)，估計(jì)其檢測(cè)靈敏度為 0.01 pg。然而，檢測(cè)限取決于樣品中所含化合物的類型和濃度以及分離程度。在某些情況下，可能還需要通過(guò)向樣品添加發(fā)射熒光的官能團(tuán)來(lái)“衍生”樣品。如果想要進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)，就需要優(yōu)化HPLC分析，包括樣品前處理。